一、服務(wù)簡介
RT -PCR即逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶反應(yīng)。原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。
逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。
二、技術(shù)流程
1、設(shè)計并合成Realtime PCR引物。
2、引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進(jìn)行含SG（SYBR?； Green）的PCR反應(yīng)的優(yōu)化。
3、客戶樣品RNA抽提 。實(shí)驗對象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提RNA。 實(shí)驗對象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加1mlRNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA 。
4、RNA質(zhì)量檢測
a、紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，以計算其濃度并評估RNA純度 。b、使用ambion公司的甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。
5.、使用逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）進(jìn)行反應(yīng)，將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
6、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品： 進(jìn)行相對定量，需要先將樣品的目的基因以及管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行 RealTime PCR擴(kuò)增和檢測。 8、檢測結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析：以對待測樣品的目的基因進(jìn)行定量。相對定量實(shí)驗需要進(jìn)一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的基因相對含量。
9、提供實(shí)驗報告：包括詳細(xì)的實(shí)驗方法及實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗結(jié)果的相關(guān)圖表
三、服務(wù)說明
1、請您提供新鮮的且盡量多的材料，或直接提供純化好的總RNA或DNA（大于5ug/樣本）。如是如織：100－200mg
2、請通過EMAIL提供已知的全長基因序列。Email:huameixinan@163.com
3、請?zhí)峁┰敿?xì)背景資料：DNA/RNA來源，豐度。
四、成果展示
五、詢價及訂購
感謝您選擇我公司的RT-PCR檢測服務(wù)。如有相關(guān)問題請聯(lián)系我們的工作人員。